Vökvasýni nota blóð-ekki æxlisvef til að greina krabbamein
Venjulega eru æxli skoðuð með vefjasýni. Lítið sýni er tekið úr æxlinu og gerðar arfgengar, eða greindar fyrir erfðaefna. Vandamálið með þessari nálgun er að vefjasýni geta verið krefjandi. Ennfremur veitir æxlisvefur aðeins skyndimynd af æxlinu.
Skrifa í Discovery Medicine árið 2015, segja Labgaa og samhöfundar eftirfarandi um hefðbundna æxlisvefsmyndun:
Af augljósum ástæðum er erfitt að fylgjast með æxlisþróun með röðarefnum. Einnig er spegilmynd aðeins spegill einn blettur æxlisins og er því ólíklegt að hann sé fulltrúi allra litrófsbreytinga í stórum æxlum. Val væri að fá margar æxlisgerðir fyrir sama æxlið, en þessi valkostur virðist hvorki raunhæf né nákvæm.
Vökvasýni felur í sér mælingu á blóðrásar DNA (ctDNA) og öðrum aukaafurðum æxlis í blóði sýnum sem fengin eru frá sjúklingum með krabbamein. Þessi greinandi nálgun bendir til þess að hún sé hröð, óbætandi og hagkvæm.
Saga Liquid Biopsy
Árið 1948, Mandel og Métais, greindist franska fræðimaður fyrst ctDNA í blóði heilbrigðra manna. Þessi uppgötvun var á undan sinni tíma, og það var ekki fyrr en áratugi síðar að ktDNA var rannsakað frekar.
Árið 1977 bentu Leon og samstarfsmenn fyrst á um hækkað magn ctDNA í blóði krabbameinssjúklinga.
Árið 1989 bentu Stroun og samstarfsmenn á eiturverkanir í blóði. Eftir þessar uppgötvanir greindust nokkrir aðrir hópar ákveðnar stökkbreytingar í æxlisbælingum og oncogenes, óstöðugleika óstöðugleika og DNA metýleringu sem sýndi að ctDNA er losað í blóðrásina með æxlum.
Þrátt fyrir að við vitum að ctDNA, sem er afleidd af æxlisfrumum, dreifist í blóðinu, eru uppruna, losunarhraði og verkunarháttur við losun þessa DNA óljós, með rannsóknum sem valda andstæðum árangri. Sumar rannsóknir benda til þess að fleiri illkynja æxli innihalda fleiri dauð krabbameinsfrumur og sleppa fleiri ctDNA. Hins vegar bendir sumar rannsóknir á að öll frumur gefa út ctDNA. Engu að síður virðist líklegt að krabbameinssjúklingar losi aukið magn ctDNA í blóðið, sem gerir ctDNA góða lífveru krabbameins.
Vegna mikillar sundrunar og litla þéttni í blóði er ctDNA erfitt að einangra og greina. Það er misræmi á ctDNA styrkleika milli sermis og plasmasýna. Það virðist sem blóðsermi fremur en blóðplasma er betri uppspretta ctDNA. Í rannsókn Umetani og samstarfsfólks kom fram að ctDNA styrkur var stöðugt lágur í plasma miðað við sermi vegna hugsanlegrar losunar á DNA í blóðrás meðan á hreinsun stendur, þar sem storknun og önnur prótein eru brotin út við sýnatöku.
Samkvæmt Heitzer og samstarfsmönnum eru hér nokkur sérstök atriði sem þarf að leysa til að nýta greiningar möguleika ctDNA:
Í fyrsta lagi þarf að staðla fyrirframgreiningaraðferðir .... Val á einangrunargreiningu sem tryggir útdrátt á nægilegu magni af hágæða DNA er mikilvægt og sýnt hefur verið fram á að preanalytical þættir blóðsýni og vinnslu geta haft veruleg áhrif á DNA afrakstur .... Í öðru lagi er eitt mikilvægasta málið að skortur er á samhæfingu á mælingaraðferðum. Mismunandi mælikvarðaraðferðir, ... framleiða mismunandi niðurstöður vegna þess að þessar mælingar miða annaðhvort algerlega eða eingöngu á magn DNA. Í þriðja lagi er minna vitað um uppruna og nákvæma aðferð við losun ctDNA, og í flestum rannsóknum varir við atburði sem gætu einnig stuðlað að losun ctDNA.
Miðaðar á móti ósjálfráðar aðferðir
Eins og er, eru tvær helstu aðferðir teknar við greiningu blóðsplasma (eða sermis) fyrir ctDNA. Fyrsta nálgunin er miðuð og leitar að ákveðnum erfðafræðilegum breytingum sem gefa til kynna æxli. Önnur nálgun er óviðkomandi og felur í sér erfðafræðilega greiningu sem leitar að ctDNA sem endurspeglar krabbamein. Að öðrum kosti hefur úthlutun raðgreininga verið notaður sem hagkvæmari, óviðkomandi nálgun. Reikningar eru hluti af DNA sem eru afrituð til að framleiða prótein.
Með markvissum aðferðum er sermi greindur fyrir þekktar erfðabreytingar í litlum hópi stökkbreytinga á bílum.
Ökutæki stökkbreytinga vísa til stökkbreytinga í erfðamengi sem stuðla að eða "reka" vöxt krabbameinsfrumna. Þessar stökkbreytingar innihalda KRAS eða EGFR .
Vegna tæknilegra framfarir á undanförnum árum hafa markaðar aðferðir við greiningu erfðafræðinnar fyrir lítil magn af ctDNA orðið gerlegar. Þessi tækni felur í sér ARMS (ófullnægjandi stökkbreytingar kerfi); stafræn PCR (dPCR); perlur, fleyti, mögnun og segulmagnaðir (BEAMing); og djúp raðgreining (CAPP-Seq).
Þrátt fyrir að tækniframfarir hafi náðst í tækni sem miðar að því að ná markvissri nálgun, miðar miðaaðferðin aðeins á nokkrar stöður stökkbreytinga (hotspots) og missir mikið af stökkbreytingum ökumanns eins og æxlislækkandi gena.
Helstu ávinningur af ósértækum aðferðum við vökvasýni er að hægt sé að nota þau hjá öllum sjúklingum vegna þess að prófið treystir ekki á endurteknum erfðafræðilegum breytingum. Endurteknar erfðabreytingar ná ekki til allra krabbameins og eru ekki sérstakar krabbameinsundirskriftir. Engu að síður skortir þessi nálgun greinandi næmi og heildar greining á æxlismyndum er ekki enn hægt.
Til athugunar hefur verð á raðgreiningu heilt erfðaefni minnkað verulega. Árið 2006 var verð að raða öllu erfðamengiinu um 300.000 $ (USD). Árið 2017 hafði kostnaðurinn lækkað í u.þ.b. $ 1.000 (USD) á erfðamengi, þar á meðal hvarfefni og afskriftir raðunarvéla.
Klínísk gagnsemi fljótandi lífsýni
Upphafleg viðleitni til að nota ctDNA var greiningar- og samanburðarstig hjá heilbrigðum sjúklingum með krabbameinssjúklingum eða þeim með góðkynja sjúkdóma. Niðurstöður þessara aðgerða voru blandaðar, með aðeins sumar rannsóknir sem sýndu marktækan mun á milli krabbameins, sjúkdómslausrar stöðu eða afturfall.
Ástæðan fyrir því að ctDNA sé aðeins hægt að nota nokkurn tíma til að greina krabbamein er vegna þess að mismunandi magn af ctDNA er unnin úr æxlum. Ekki öll æxli "úthellt" DNA í sama magni. Almennt, fleiri háþróaður, útbreidd æxli varpa meira DNA í blóðrásina en gera snemma, staðbundin, æxli. Að auki varpað mismunandi magn af DNA í blóðrásina á mismunandi gerðum æxlis. Hlutfall DNA í blóðrás sem er afleiðt af æxli er víða breytilegt milli rannsókna og krabbameinategunda, allt frá 0,01% til 93%. Það er mikilvægt að hafa í huga að almennt er aðeins minniháttar ctDNA afleidd úr æxlinu, en afgangurinn kemur frá eðlilegum vefjum.
Hringlaga DNA gæti verið notað sem forvarnarmerki sjúkdóms. Hringlaga DNA gæti verið notað til að fylgjast með breytingum á krabbameini með tímanum. Til dæmis sýndi einni rannsókn að tveggja ára lifunartíðni hjá sjúklingum með krabbamein í endaþarmi (þ.e. fjöldi sjúklinga sem lifðu að minnsta kosti tveimur árum eftir greiningu með krabbameini í ristli í endaþarmi) og stökkbreytingar KRAS voru 100 prósent í þeim sem voru án sannana um samsvarandi blóðrásar DNA. Þar að auki er mögulegt að hægt sé að nota blóðrásar DNA í náinni framtíð til að fylgjast með forvarnarskemmdum.
Hringlaga DNA gæti einnig verið notað til að fylgjast með svörun við meðferð. Vegna þess að blóðprufur DNA próffers eru betri heildar mynd af erfðafræðilegum smit æxla, inniheldur þetta DNA líklega greiningar DNA, sem hægt er að nota í stað þess að greina DNA sem myndast úr æxlum sjálfir.
Nú skulum við skoða nokkrar sérstakar dæmi um fljótandi lífsýni.
Guardant360
Guardant Health þróaði próf sem notar næstu kynslóðarkerfi til að fá upplýsingar um blóðmyndandi DNA fyrir stökkbreytingar og litningabreytingar fyrir 73 krabbameins tengdar gen. Guardant Health birti rannsókn þar sem greint var frá gagnsemi vökvasýni í krabbameini. Rannsóknin notaði blóðsýni úr 15.000 sjúklingum með samtals 50 æxlisgerðir.
Að mestu leyti eru niðurstöður úr vökvasýni í samræmi við breytingar á genum sem fram koma í æxlisvefjum.
Samkvæmt NIH:
Guardant360 benti á sömu mikilvæga stökkbreytingar í mikilvægum krabbameinsbundnum genum eins og EGFR, BRAF, KRAS og PIK3CA við tíðni sem er mjög svipað því sem áður hafði verið skilgreint í æxlisýni og tölfræðilega fylgni við 94% í 99%.
Enn fremur, samkvæmt rannsóknarnefndinni, skýrðu vísindamenn eftirfarandi:
Í annarri þáttur rannsóknarinnar metðu næringarfræðingar næstum 400 sjúklingar, sem flestir höfðu lungnakrabbamein eða krabbamein í endaþarmi, sem höfðu bæði blóð ctDNA og æxlisvef DNA niðurstöðurnar tiltækar og borið saman við mynstur gena breytinga. Heildar nákvæmni vökvasýni í samanburði við niðurstöður úr æxlisvefsmynduninni var 87%. Nákvæmni jókst í 98% þegar blóð og æxlissýni voru safnað innan 6 mánaða frá hvor öðrum.
Guardant360 var nákvæm, jafnvel þó að blóðflæði DNA í blóðinu væri lágt. Oftast, blóðmyndandi æxlis DNA var aðeins 0,4 prósent af DNAinu í blóði.
Á heildina litið, með því að nota fljótandi vefjasýni, var Guardant vísindamennirnir að bera kennsl á æxlismerki sem gætu beinst lækni hjá 67% sjúklinga. Þessir sjúklingar voru gjaldgengir í FDA-samþykktum meðferðum sem og rannsóknarmeðferð.
ctDNA og lungnakrabbamein
Árið 2016 samþykkti FDA Cobas EGFR Mutation Test til að greina EGFR stökkbreytingar í blóðrás DNA hjá sjúklingum með lungnakrabbamein. Þessi prófun var fyrsta FDA-samþykkt vökvasýni og tilgreindir sjúklingar sem geta verið frambjóðendur til meðferðar með markvisum meðferðum sem nota erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) og gefitinib (Iressa) sem fyrsta meðferð og osimeritinib (Tagrisso) sem annarri meðferð. Þessar markaðar meðferðir ráðast á krabbameinsfrumur með sértækum EGFR stökkbreytingum.
Mikilvægt, vegna mikils fjölda rangra neikvæðra niðurstaðna, mælir FDA að vefjasýni verði einnig tekin frá sjúklingi sem hefur neikvæð vökvasýni.
ctDNA og lifrarkrabbamein
Fjöldi fólks sem deyr af lifrarkrabbameini hefur aukist á undanförnum 20 árum. Núna er lifrarkrabbamein næst leiðandi orsök krabbameinsdauða í heiminum. Það eru engar góðar lífmælikvarðar til að greina og greina lifrar- eða lifrarfrumukrabbamein (HCC), krabbamein. Hringlaga DNA gæti verið góður lífvera fyrir lifrarkrabbamein.
Íhuga eftirfarandi tilvitnun frá Lagbaa og samhöfundum um möguleika á að nota blóðmyndandi DNA til að greina lifrarkrabbamein:
Hypermethylation af RASSF1A, p15 og p16 hefur verið lagt til sem snemma greiningartæki í afturvirkri rannsókn þar á meðal 50 HCC sjúklingum. Undirskrift fjórum aberrantly metýleruðu gena (APC, GSTP1, RASSF1A og SFRP1) var einnig prófuð vegna greiningar nákvæmni en metýleringu RASSF1A var tilkynnt sem prognostic biomarker. Eftirfarandi rannsóknir greindu ctDNA hjá sjúklingum með HCC með því að nota djúp raðgreiningartækni. Áberandi DNA-afritunar tölur voru greindar í tveimur HBV burðarefnum án fyrri sögu HCC við blóðsöfnun en sem þróaði HCC meðan á eftirfylgni stóð. Þessi uppgötvun opnaði hurðina til að meta fjölda afrita í ctDNA sem skimunarverkfæri fyrir snemma HCC uppgötvun.
Orð frá
Vökvasýni eru spennandi nýr nálgun á erfðafræðilegri greiningu. Eins og er, eru ákveðin vökvasýni, sem bjóða upp á alhliða sameindarprófun, tiltækar læknum til viðbótar erfðafræðilegum upplýsingum frá vefjasýni. Það eru einnig ákveðnar fljótandi vefjasýni sem hægt er að nota í stað vefjasýni - þegar vefjasýni eru ekki tiltæk.
Mikilvægt er að hafa í huga að margir fljótandi æxlisprófanir eru í gangi og þörf er á frekari rannsóknum til að útskýra lækningalega gagnsemi þessa íhlutunar.
> Heimildir:
> Blóðpróf fyrir erfðafræðilegar breytingar á æxlum sýnir loforð sem val til æxlismyndunar. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Hringlaga Tumor DNA sem Liquid Biopsy fyrir krabbamein. Klínísk efnafræði. 2015; 61: 112-123. doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Vökvasýni í lifrarkrabbameini. Discovery Medicine. 2015; 19 (105): 263-73.
> Liquid Biopsy: Notkun DNA í blóðinu til að uppgötva, fylgjast með og meðhöndla krabbamein. NIH.
> Umetani N, et al. Hærri magn af DNA sem er frjáls blóðrás í sermi en í plasma er ekki aðallega af völdum smitaðrar utanaðkomandi DNA meðan á aðskilnaði stendur. Ann NY Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Almennar meginreglur í lyfjameðferð krabbameins. Í: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 13e New York, NY: McGraw-Hill.